請問分子病理學的地位和應用？

地位：分子生物學的發展, 是人們對腫瘤細胞增殖生長和轉移過程中的信號轉導通路作用機制研究的不斷深入，繼而為其特異性靶點而設計的分子靶向藥物的開發,使腫瘤治療已經進入了一個全新的時代。同時也為病理學提出了新的挑戰，并注入了新的活力。病理學不再局限于組織和細胞水平的診斷，而開拓了分子病理學的新領域：不僅為尋找新的分子靶點提供線索，還可以通過基因檢測為分子靶向治療提供依據，從而使靶向治療做到更有的放矢。目前有應用前景的靶點包括蛋白激酶、腫瘤血管生成、細胞周期調控等方面，這其中尤以針對突變激酶靶點的治療取得的進展喜人。

分子病理學的應用

一、伊馬替尼治療胃腸道間質瘤（Gastrointestinal Stromal Tumors GIST）與c-kit、PDGFRA基因檢測

Imatinib mesylate（伊馬替尼，過去稱STI157，商品名Glivec 或Gleevec）治療GIST是近年來一個成功的分子靶向治療模型，而有關GIST以基因型為基礎的治療還有許多問題有待解決。深入研究GIST的分子病理機制可以為完善其分子靶向治療方案提供實驗依據，并為其它腫瘤特異靶點的發現提供線索。

1.伊馬替尼用于治療GIST的分子基礎

2001年伊馬替尼的出現標志著針對腫瘤細胞信號轉導通路的抗腫瘤戰略取得了令人矚目的突破。伊馬替尼是一種酪氨酸蛋白激酶抑制劑，是第一個基于對腫瘤細胞信號轉導機制的認識而開發的抗癌藥物，在原癌基因性的酪氨酸激酶和伊馬替尼之間的基因型與藥物的反應關系對于研發其它腫瘤的靶向信號轉導抑制劑提供了一個有意義的模型[1]。最初伊馬替尼的研發是作為血小板衍生生長因子受體 (PDGFR)的特異性抑制劑，而后發現其能選擇性地抑制Bcr-Abl蛋白激酶從而抑制白血病細胞的生長及腫瘤的形成，且不影響對正常細胞生長和增殖起作用的激酶，對治療Bcr-Abl 陽性的慢性粒細胞性白血病有較好療效。Buchdunger等人后來發現伊馬替尼還能阻斷酪氨酸蛋白激酶受體KIT的功能，使人們把它與GIST聯系起來。GIST對傳統的化療和放療無效，臨床試驗證實伊馬替尼對難切性和/或轉移性GIST非常有效，目前已經用于晚期不能切除的GIST，而且開始應用于術后的高復發危險的患者的輔助治療。我國自2001年亦開始應用伊馬替尼治療GIST，并獲得相當效果。

GIST是胃腸道最常見的間葉性腫瘤，每年發生在美國至少為2000～5000例，在中國，發生率也有逐年上升的趨勢。GIST可發生于胃腸道的任何部位，以胃和小腸最為多見，少部分發生于網膜、腹腔等。近年研究發現GIST與胃腸的間質Cajal細胞 (ICC) 在形態和免疫表型以及超微結構上具有相似性，都具有表達KIT蛋白的特征，提示GIST可能起源于向ICC分化的干細胞。由于目前普遍認為GIST沒有絕對的良性，尚未發現可以特異性預測惡性轉變的指標。依據Fletcher 2000年提出的GIST生物學行為分級標準可分為極低度、低度、中度和高度侵襲危險性，最終惡性的判斷取決于腫瘤的復發或轉移。這就為從分子病理學角度上重新認識GIST提出了迫切的任務。

由原癌基因c-kit編碼的KIT蛋白屬于III型酪氨酸蛋白激酶跨膜受體（RTK），由胞內的酪氨酸激酶區、跨膜區和帶有配體結合位點的胞外區構成。在與其配體干細胞因子（SCF）結合后發生二聚體化，激活自身酪氨酸蛋白激酶活性，使受體殘基發生磷酸化，引起胞漿內具有SH2功能域的信號轉導蛋白與受體結合，進而激活下游的信號傳導通路，如Ras/Raf/MEK/MAPK通路，PLC?/DAG/IP3通路，PI-3K/AKT通路，JAK/STAT通路等，引起一系列的細胞變化，在包括增殖、粘附、凋亡和分化的腫瘤發生過程中調控細胞功能[2]。因此KIT原癌蛋白的表達是GIST發生的核心事件，也是目前普遍認可的確定GIST的特異敏感標準 (CD117陽性)。闡明KIT信號通路對臨床同樣具有重要意義。因為GIST病人可能最終對KIT抑制療法耐藥，因此人們正在努力研究發現下游信號中重要的蛋白分子以作為對KIT抑制療法耐藥的新靶點。

2．c-kit基因檢測對伊馬替尼治療GIST的意義

1998年報道GIST中存在c-kit的基因突變，使其在無配體結合的情況下，KIT蛋白仍然能保持持續的自身酪氨酸蛋白激酶活性，從而激活下游的信號轉導通路。目前認為kit的這種獲得功能性的突變是GIST發生的重要機制。其中在kit基因編碼近跨膜結構域的11號外顯子中的突變最為常見，占50%～92%，此外在胞外結構域的9號外顯子、激酶結構域的13號外顯子和磷酸轉移酶結構域的17號外顯子的突變分別占8～13%、0～4%和0～4%。其中11號外顯子的突變形式多樣，包括框內缺失突變、點突變和框內串聯重復（Identical Tandem Duplication ITD）插入突變。國內有關GIST分子檢測的報道還很少，多集中在11號外顯子突變，且樣本量較小，突變率低，為30.8%（14/52）和41.5％（34/82），而未見9、13、17號外顯子突變的報道。我們的60例GIST小樣本研究顯示其中38例（63.3％）檢測到kit突變，均為CD117陽性：其中35例（58.3％）為11號外顯子突變，2例（3.3％）為9號外顯子突變，僅1例（1.7％）13號外顯子突變，未檢測到17號外顯子的突變[3]。進一步擴大樣本100例GIST中68％檢測到kit突變(未發表)。似乎9號外顯子在我國GIST的突變率明顯低于國外，因為有研究指出9號外顯子屬于較特殊的一種突變亞型，往往發生在胃外，生物學行為屬高度侵襲危險性。我國的這種（原診斷為惡性）GIST比例明顯高于國外，且發生在胃外的并不少見，國人GIST是否有不同的基因突變位點譜，需要進行大樣本研究。近來不少研究試圖將突變比例與組織學特征和臨床行為相聯系，早期有一些報道進展期或高度侵襲危險性的GIST中突變多見，但目前多數報道提示基因突變情況與進展性行為有關的腫瘤大小、分裂相或分期等因素之間無明顯相關性。國內相關文獻均為高度侵襲危險性者突變常見，而我們的初步結果顯示即使是因其它疾病偶然發現的直徑小于1厘米的GIST中也有相當比例攜帶11號外顯子突變，同Antonescu CR的結果一致。因此需要大樣本進行統計分析，找尋我國GIST基因型與病理、臨床特點間的規律，并進一步明確kit突變在GIST發生中的作用。

kit突變本身是否與病人的預后相關，目前尚無定論。有研究表明kit突變是一個生存的獨立預后指標，即有突變者的5年生存率要低于無突變者。且有研究指出具11號外顯子的點突變者較缺失和插入突變者生存率高。

伊馬替尼的應用可明顯改善病人的預后。已有資料證實kit突變的位置能影響GIST對伊馬替尼的反應。一些體外和臨床研究已表明突變在激酶位點的病例對抑制劑并不有效，如與肥大細胞增生癥相關的激酶區D816V突變。幸好大多數kit突變都位于調控區即非酪氨酸激酶結構域，這就使抑制劑能有效地封閉酶位點。并且11號外顯子有突變者與沒有突變者和9號外顯子突變者相比，對伊馬替尼的部分緩解率（partial response rate）明顯提高，平均生存期延長，病情進展緩慢[4～5]。

同時亦有研究提示伊馬替尼可以通過促進NK細胞活性等其他途徑來起到和增強其抗腫瘤作用。即使是KIT低表達的GIST, 伊馬替尼亦具有一定的治療作用。

因此檢測病人手術標本中c-kit基因突變的情況對判斷伊馬替尼應用的預后有重要意義。

3．PDGFRA基因檢測與GIST

對于缺乏 kit 突變的GIST的發生，近年來日益受到研究者的關注。由于發現即使是在包含野生型 kit 的GIST中KIT 也活化，就把人們的目光引向KIT 相關的受體酪氨酸激酶（RTK）。這一類RTK包括前原癌基因FMS，其編碼巨噬細胞集落刺激因子 (M-CSF1) 的受體；兩個PDGFR基因：包括PDGFRA和PDGFRB；FLT1與FMS相關的一個前原癌基因。其中PDGFRA 基因和 kit 基因位于人4號染色體的相鄰位置上，兩者的氨基酸序列有很高的同源性。近來國外報道在28%～67% 無kit突變的GIST中檢出了 PDGFRA 的突變，并且 PDGFRA 突變與 kit 突變是相互獨立的。因此目前認為獲得功能性的 PDGFRA 突變很可能是 GIST 的另一個病因。一方面PDGFRA的信號轉導通路與kit 相似，功能性的 PDGFRA 突變可以轉化小腸的 Cajal 細胞；另一方面PDGFRA的功能性突變在293T 細胞中能與野生型的 kit 結合并使之活化。這一發現進一步證實了III型RTK的激活在促進GIST發生中的核心作用。國內尚無有關PDGFRA突變的報道。我們在60例中的3例檢出了PDGFRA突變（5％），占無KIT表達病例的50％，全部為 18號外顯子（活化環結構域）的點突變D842V，為最常見的突變形式。未檢測到12號外顯子（近膜結構域）的突變。與Medeiros等人的報道相似，此類突變多見于發生在網膜/腸系膜的惡性病例。而最近Lasota J的較大量病例研究表明PDGFRA突變主要發生在胃部，且大多生物學行為呈“良性”經過[6]。因此我國PDGFRA突變的突變情況還需擴大病例數進行研究。

目前證實PDGFRA 18號外顯子突變對抑制劑療效不明顯，但仍有30％PDGFRA 突變的病例對伊馬替尼敏感的報道提示我們應重視KIT陰性GIST的診斷問題以及應進行相應基因突變檢測判斷能否適用于伊馬替尼治療。

由此是否可能將GIST按照分子水平上的改變分成至少三種類型，即kit 突變型、PDGFRA突變型和無突變型。因此GIST可以看作是在大多數情況下由單獨的分子機制所驅動的腫瘤。而絕大多數人類的癌發病機制復雜，如能按照具有明確的分子改變分類，就有可能針對每一類型實施以特定分子為基礎的治療。由于絕大多數GIST有KIT的高表達，即使是在不具有基因突變的病例中，因此這部分GIST的發生源于何種啟動因素，目前尚無相關研究。Kit突變是GIST發生的早期事件，且具有突變的“良性”GIST 大多數并不進展為“惡性”，這表明kit突變本身并不能引起GIST的惡性轉化。而導致GIST惡性轉化的因素目前還未知。

4．c-kit基因、PDGFRA基因檢測與伊馬替尼治療GIST耐藥

盡管伊馬替尼在治療GIST上取得了令人鼓舞的成績，卻不可避免的出現了耐藥的問題。初步的研究表明耐藥包括KIT依賴性或KIT非依賴性機制。多數病例的耐藥可能還是源于KIT的再活化。這其中部分病例是因為獲得了存在于或者接近藥物－蛋白相互作用位點的突變或是能導致蛋白構象發生改變而使KIT與伊馬替尼親和力降低的突變，削弱了藥物的效能。最近Chen LL等人報道了5例具有對伊馬替尼敏感的外顯子9或11突變的GIST病人在用藥過程中發生了耐藥，獲得一種新的點突變-V654V，位于kit酪氨酸激酶結構域[7]。這一耐藥很可能是由于KIT蛋白構象改變所致。

有意思的是最近Debiec-Rychter報道了一個新機制：一例病人由kit-G565R突變通過PDGFRA次級突變D842V而對伊馬替尼產生耐藥[8]。這一現象表明對伊馬替尼耐藥可以通過另一個激酶的突變（如PDGFRA）而實現。部分病例對伊馬替尼的不敏感可能與c-kit或PDGFRA基因擴增有關。因此對于GIST病人不主張使用傳統化療，可能會促進與疾病演進相關的克隆分化進展，產生影響藥物反應的基因改變。KIT非依賴性機制耐藥的提出是基于發現有病例徹底失去了KIT的表達。通過間期FISH證實標記的kit/PDGFRA基因在等位基因上丟失。同時他們還通過實驗發現對伊馬替尼耐藥的幾種突變對PKC412，另一種KIT和PDGFR的抑制劑， 反應敏感。這為尋找伊馬替尼耐藥的替代品提供了有意義的線索。部分病例發生耐藥的原因還不得而知，還有很多問題需要進一步研究。

綜上，深入研究GIST發生、發展及治療有效、耐藥的分子機制可以為生物靶向治療提供依據和新的靶點。

二、 Herceptin治療乳腺癌與HER2/ neu (cerbB2 )基因過表達的檢測

1．Herceptin治療乳腺癌的分子基礎

HER2/ neu 是EGFR（表皮生長因子受體）家族的一員，此家族在細胞信號轉導中發揮重要作用，是細胞生長、分化及存活的重要調節者。通常情況下，HER2/ neu 只在胎兒期表達。到成年后，只在極少數組織內有低表達。而HER2/ neu正常基因產物的過度表達，已證實在卵巢癌、肺腺癌、原發性腎細胞癌等，尤其是乳腺癌的惡性轉化上起了關鍵性的作用，并且是預后不良的指征。

由于HER2/ neu 的過表達與腫瘤發生密切相關,人們找到了一種抗HER2/ neu 的抗體來下調其表達,命名為Trastuzumab ( Herceptin) 。其通過直接和間接兩種機制影響腫瘤生長：直接機制是抗體與HER2/ neu 結合改變了受體的信號傳導功能。間接機制是抗體通過ADCC 和補體依賴的細胞毒作用殺傷腫瘤細胞，還可誘導細胞分化,誘導細胞凋亡。目前已成功應用于治療HER2/ neu基因擴增或過度表達伴或不伴腋窩淋巴結轉移的乳腺癌患者。Herceptin無論單用還是聯合化療，無論作為一線還是二線選擇，都是一個治療乳腺癌轉移的重要選擇藥物。由于其毒副反應小，患者耐受性好，已成為靶向性治療的成功范例。

2．HER2/ neu基因過表達的檢測方法

如何準確、方便地檢測出HER2/ neu基因過表達的乳腺癌病例，為運用Herceptin 治療提供依據以及判斷預后，就成為病理工作者不斷研究的課題。

目前最常用的方法有ELISA、FISH（原位雜交免疫熒光）及IHC（免疫組化）法。ELISA法主要用于檢測乳腺癌患者血清或新鮮組織中的p185 總蛋白。此方法敏感、 簡單、安全且費用低，但僅適用于新鮮標本，不適用石蠟包埋組織。FISH法用于檢查分裂期細胞的核型、識別染色體數目、確定腫瘤細胞的來源。此方法特異性高且穩定、敏感，能直接觀察HER2/ neu基因的擴增量。 缺點主要是價格較貴，難以普及。IHC法因操作簡便，目前被廣泛應用。但假陰性較高，且對陽性信號程度的判讀上主觀因素影響較大。我們正在試驗用real-time PCR（實時監測聚合酶鏈反應）來檢測HER2/ neu基因過表達。這項方法是分析mRNA擴增的水平，基于實時檢測PCR 擴增的產物,不需要一般的PCR 的產物處理,因而避免了因為操作所產生的各種問題[9]。能夠動態監測整個PCR 過程,具有定量性和實用性。需要特別強調的是只有對上述檢測方法進行統一規范化，才能提供準確的HER2/ neu基因狀態，為治療提供可靠的依據。

3. 其他

除了上述兩種成功應用的藥物外，還有許多分子靶向藥物也顯示出很好的應用前景。如部分肺癌病例，對EGFR抑制劑治療有效，與其EGFR激酶結構域的突變有關。 近來抑制腫瘤介導的血管生成為腫瘤治療提供了非細胞毒性的新途徑。A vastin(Bevacizum ab, rhuMAb－VEGF) 是第一個人重組的抗VEGF 單抗, 能夠結合并阻斷VEGF (血管內皮生長因子) 的作用, 從而發揮抗腫瘤活性。其療效除了與間質血管形成模式有關外，還與腫瘤表達VEGF的水平相關[10]。

可以預想，在今后對于腫瘤分子靶向治療的研究和運用中，分子病理學必將起到更大的作用，同時，也促進其與臨床緊密結合，向更具實用性發展。

merck millipore的ni-nta buffer kit怎么樣

蛋白過鎳柱純化的原理：Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有HIs（組蛋白）標簽的堿性蛋白蛋白結合，組蛋白標簽一般是6個組氨酸（堿性氨基酸）。

在蛋白上樣后，帶有組氨酸標簽的蛋白特異性結合到柱子里，其他的雜蛋白流出。

Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以也可以與咪唑結合這時候再用咪唑洗脫，梯度洗脫，咪唑競爭性結合到硫酸鎳上，目的蛋白就被洗脫了，這時候收集浸出液，那么里面就是要的目的蛋白，然后透析掉咪唑就行了。

現在的柱子大多是預裝柱，也就是不用自己填柱，就是裝好鎳的傻瓜柱，也不貴，上樣，洗脫，基本兩個步驟就結束了。

剩下的看怎么處理了。

npy是什么意思

NPY（Neuropeptide Y，神經肽Y）由下丘腦分泌，是一種多肽，由三十六個氨基酸構成。

NPY是一個36個氨基酸的肽，廣泛分布于中樞和外周神經系統。許多證據表明NPY在體重調節中起到重要的作用，NPY最主要的作用是增加食物的攝入，降低飽食動物的產熱效應。

NPY的相關發現：

2016年12月27日Front Aging Neurosci雜志發表了題為“神經肽Y（NPY）mRNA表達水平在不同抑郁癥類型中的鑒別作用”的文章。該研究是袁勇貴主任醫師及其團隊的系列研究之一，通過入組159例受試者，其中PSD患者39例，卒中非抑郁（Non-PSD）患者42例，抑郁癥（major depressive disorder，MDD）患者40例和正常對照（normal control，?NC）組38例，探討外周血NPY在PSD中的發生作用。

研究結果發現與NC組相比，PSD和Non-PSD蛋白水平顯著降低；與MDD組相比，PSD和Non-PSD組NPY mRNA水平顯著升高。

以上內容參考：

百度百科-NPY

如何用氨基酸序列設計引物啊，設計好的引物如何評判，可以與相應的核酸序列作對比以改進嗎？

首先你得氨基酸序列是不是已知蛋白的序列，也就是在GENE BANK里能不能找到你的氨基酸對應的蛋白，如果知道是什么蛋白，那么就用該蛋白對應的DNA序列設計引物，設計引物可以用Primer軟件，至于引物的評分可以參照軟件給出的一些參數，比如是否有DIMER形成，TM值，有無錯配等等。選擇評分比較高的引物，進行合成，然后PCR擴展試試，看看目的條帶能不能出來，事實說話，擴得出來且沒有雜帶就是好的引物。

如果，你的氨基酸序列是未知蛋白的序列，那么你就得麻煩點了：1.從氨基酸序列中選擇氨基酸對應密碼子種類比較少的一段設計引物.2.考慮到密碼子偏好性，如同一氨基酸的密碼子，在不同物種中對某種密碼子偏好。3.如果某個氨基酸的密碼子有四種可能，那就在引物中使用I。4.為了降低引物的兼并性，提高PCR反應的特異性，設計多條引物分別擴增。5.設計一條兼并引物以后，另一條引物可以使用oligodT，如果要做5‘RACE，可以考慮使用clotech的SMART cDNA amplification Kit。

如果還有什么疑問在留言吧。希望好運

NRAS KIT MET三種基因突變分別代表什么？

一般來說，基因突變有三種形式：

1、錯義突變：

由于一對或幾對堿基對的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變成決定另一種氨基酸的密碼子的基因突變叫錯義突變。

這種基因突變有可能令它所編碼的蛋白質部分或完全失活，比如人血色素β鏈的基因假若將決定第6位氨基酸（谷氨酸）的密碼子由CTT變成CAT，就可使它合成出的β鏈多肽的第6位氨基酸由谷氨酸變成纈氨酸，從而造成鐮刀形細胞貧血病。