測定蛋白質中氨基酸含量的主要步驟有哪些？為什么一般分析報告顯示17種氨基酸成分？

一般來說人體必須的17種氨基酸，也較為重視

氨基酸的定性測定

一、氨基酸的一般顯色反應

本節介紹三種顯色反應：茚三酮法、吲哚醌法和鄰苯二甲醛法。前二種是經典的常用顯

色法，后一種是近年來發展起來的熒光顯色法，具有靈敏度高的特點。

1. 茚三酮法

顯色方法有下列數種：

①常用法：將點有樣品的層析或電泳完畢的濾紙充分除盡溶劑，用 5g/L 茚三酮無水丙

酮溶液噴霧，充分吹干，置65℃烘箱中約30min（溫度不宜過高，避免空氣中氨，以免背

景泛紅色），氨基酸斑點呈紫紅色。

為了使各種氨基酸呈現不同顏色，可用下列方法：

②用 0.4g 茚三酮，10g 酚和90g 正丁醇的混合液顯色。

③用 1g/L 茚三酮無水丙酮溶液顯色完畢后，再用鹽酸蒸汽熏1min。

④用 1g 茚三酮，600mL 無水乙醇，200mL 冰醋酸及80mL2,4,6-三甲基吡啶混合液80

℃染色5～10min。

為了使顯色穩定，可用下列方法：

⑤配制含醋酸鎘 2g 加蒸餾水200mL 及冰醋酸40mL 的貯存液。將上述貯存液加200mL

丙酮及2g 茚三酮，即為顯色液。點有樣品的濾紙上浸有此顯色液后，放置于盛有一小杯濃

硫酸的密閉玻璃容器中，25℃，18h，或較高溫度下適當縮短時間。背景色淺，氨基酸斑點

也比較穩定。

⑥用含 2g/LCoCl2(或CuSO4)的4g/L 茚三酮異丙酮溶液顯色時，氨基酸斑點呈紅色，也

可在茚三酮顯色后噴以含鈷、鎘或銅等無機離子的異丙醇溶液，斑點自藍紫色變成紅色。

2．吲哚醌法

（1）原理

各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色，因此可借此辯認氨基酸。氨對吲哚醌顯色沒

有妨礙，但其靈敏度較茚三酮法稍差，顯色不穩定，顏色只有在絕對干燥的環境中才能保存。

（2）試劑

①顯色劑：1g 吲哚醌溶于100mL 乙醇及10mL 冰醋酸中（若冰醋酸用量減少則靈敏度

稍差）。

②底色褪色劑：在 100mL 200g/L 碳酸鈉溶液中加入60g 硅酸鈉（Na2SiO3?9H2O）在水

浴（60～70℃）中加熱攪拌直至完全溶解，待溶液比較清澈為止。在溶解過程中，有時硅酸

鈉會結成凝膠，此時只需繼續攪拌即可溶解。配制時若硅酸鈉用量多則褪色較快，但背景容

易變黃，硅酸鈉用得少（40g），雖裉色較慢，但背景較為潔白。

顯色步驟

層析或電泳后濾紙烘干后，仔細噴上或涂上顯色劑，用電吹風迅速吹干，待醋酸氣味不

太刺鼻時移置100℃烘箱烘5～15min，直至顯色為止（溫度不要太高，以免引起減色）注

意觀察所顯出的顏色，然后均勻地涂上底色褪色劑，紙的背景即由黃色變為絳紅而后逐漸變

淺，待黃色背景幾乎褪盡時，迅速用電吹風吹干，并隨時觀察顏色的變化。例如蘇氨酸在褪

色前為淺紅帶褐色，褪色后則呈橙黃色或黃色：脯氨酸在褪色前為藍色，吹干時很快褪成無

色。室溫較低時，底色褪色很慢，此時可將褪色劑加溫到30～40℃。溫度過高也不宜，因

氨基酸斑點的褪色速度也同時加快，應該避免。

其他顯色步驟：顯色劑為 1g 吲哚醌，1.3g 醋酸鋅溶解于70～80mL 熱異丙醇中，冷卻

后加1mL 吡啶。或者1g 吲哚醌，1.5g 醋酸鋅溶解于95mL 熱異丙醇中，加3mL 水，冷卻

后加1mL 冰醋酸。點有樣品的濾紙仔細噴以顯色劑后，80～85℃放置10min，背景可用水

迅速浸洗去而不使氨基酸斑點退去

由于吲哚醌試劑配制方法不同，對同一種氨基酸所顯顏色往往也有差異。

3．鄰苯二甲醛法

鄰苯二甲醛法是目前紙上層析、硅膠薄層層析熒光顯色氨基酸最靈敏的方法之一，也可

用于氨基酸溶液定量，并推廣應用于乙內酰苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白質的檢出和定量。根

據文獻報道，氨基酸紙上層析靈敏度達0.5μmoL，在硅膠薄層層析上為0.05～0.2μmoL。

這里介紹在紙上層析顯現氨基酸方法。（熒光胺是另一種常用的熒光試劑，由于熒光胺來源

比較困難，這里未作介紹）

（1）原理

鄰苯二甲醛在 2-巰基乙醇存在下，在堿性溶液中與氨基酸作用產生熒光化合物，最適

的激發光和發射光波長分別為340nm 和455nm。

各種氨基酸顯現的熒光強度不同，其相對熒光強度由大到小大致順序如下：天門冬氨酸，

異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨

酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。

（2）試劑

鄰苯二甲醛顯色液：取0.1g 鄰苯二甲醛，0.1mg 巰基乙醇，1mL 三乙胺，加丙酮+石油

醚（60℃～90℃）（1+1）的混合溶劑至100mL。放置0.5h 后使用。

顯色步驟

將含有氨基酸樣品的濾紙浸入鄰苯二甲醛顯色液中 1min，冷風吹干，在溫度18℃以下，

濕度50%～90%之間顯色0.5h，于紫外燈下觀察熒光點。

說明

在濾紙上顯現氨基酸時，鄰苯二甲醛濃度以 0.1%為宜。顯色時必須有一定的濕度，以

便氨基酸溶解，提高分子碰撞機率，并使極性基團解離，促進反應趨于完全。濕度太低，顯

不出熒光。溫度對顯現的熒光延時有顯著影響，溫度高熒光延時短，溫度低熒光延時長。

二、個別氨基酸的顯色反應

利用個別氨基酸與某些試劑具有特殊的顯色反應定性氨基酸。可應用于紙層析和紙電

泳顯色，也可單獨應用。方法很多，僅將常用的方法介紹如下：

1．精氨酸的顯色——坂口（Sakaguchi）反應

(1)第一種方法

試劑：①5g 尿素溶解于100mL0.1g/Lα-萘酚乙醇中。使用前，每100mL 加約5g KOH。

②0.7mL 溴水溶解于100mL 5%NaOH 中。

顯色步驟：在點有樣品的濾紙上噴試劑①后，在空氣中吹幾分種，再噴試劑②。精氨

酸或含精氨酸的多肽顯紅色。此試劑對含精氨酸的蛋白質也適用。

(2)第二種方法：

試劑：①1g/L 8-羥基喹啉的丙酮溶液。②0.02mL 溴水溶解于100mL 0.5mol/LnaOH 溶

液中。

顯色步驟：將點有樣品的濾紙烘干后，噴上試劑①，吹干后，再噴試劑②。精氨酸或

其他胍類物質顯桔紅色。

2．胱氨酸和半胱氨酸的顯色

試劑：①1.5g 亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5NO2?5H2O）溶于5mL 2mol/L H2SO 4 溶液

中，加95mL 甲醇。此時會有沉淀產生，可保存一個月以上。使用時在每100mL 上述溶液

中加10mL 28%氨水，過濾除去沉淀，清液僅能保持一天左右。②2g 氰化鈉溶于5mL 水中，

然后加95mL 甲醇。此時有沉淀產生，使用時只需搖勻即可。

顯色步驟：半胱氨酸的顯色：在濾紙上噴以試劑①的清液，5min 后半胱氨酸顯紅色。

胱氨酸的顯色：先將濾紙浸入試劑②，迅速取出，稍等片刻再噴試劑甲的清液，5min 后胱

氨酸顯紅色。也可以把試劑②配制的濃度增加一倍，在顯色前混和，再噴到濾紙上。

3．甘氨酸的顯色

試劑；0.1g 鄰苯二甲醛溶于100mL 77%乙醇中。

顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上試劑，甘氨酸顯墨綠色，在汞燈（365nm）下顯巧克力

棕色。吲哚醌顯色后，再用此試劑仍有效。以甘氨酸為N 端的小肽也能顯色，但其N 端被

保護后，以及其他氨基酸均不顯色。

4．脯氨酸的顯色

試劑：1g 吲哚醌和1.5g 醋酸鋅，1mL 醋酸，5mL 蒸餾水混和，再加入95mL 異丙醇。

新鮮配制。

顯色步驟：層析濾紙除盡溶劑，噴上以上試劑，80℃～85℃烘箱內放置30min，脯氨酸

顯藍色，再以30℃溫水漂洗除去多余的試劑后，背景為白色或淺黃色。

也可剪下脯氨酸斑點，在試管中加入5mL 水飽和酚，在黑暗中洗脫15min，間歇振搖，

于610nm 測定其吸光度。從已知標準曲線即可求得樣品內脯氨酸含量，測定范圍5～20μg。

5．絲氨酸和羥賴氨酸的顯色

試劑：①0.035mol/L 過碘酸鈉（748mgNaIO4 溶于數毫升甲醇中，加2 滴6mol/L 鹽酸，

再用甲醇稀釋至100mL）。②15g 醋酸銨加0.3mL 冰醋酸，加1mL 乙酰丙酮，用甲醇稀釋到

100mL。

顯色步驟：點有樣品的濾紙吹干，先噴試劑①，近干后再噴試劑②，室溫放置 2h，紫

外燈下照射0.5h，絲氨酸和羥賴氨酸呈黃色斑點，在紫外線下都有熒光。

6．羥脯氨酸的顯色

試劑：①1g 吲哚醌溶于100mL 乙醇及10mL 冰醋酸。②1g 對二甲胺苯甲醛溶于100mL

的丙酮濃鹽酸（9＋1）混合液中。（此試劑不穩定，隔數日后溶液顏色增深發黑，靈敏度降

低，故用時新鮮少量配制。

顯色步驟：將待鑒定的溶液點于小方塊紙上，干后先點上試劑①，熱風吹干。這時純

羥脯氨酸呈墨綠色，純脯氨酸呈深藍色（極靈敏），對其他氨基酸呈程度不同的紫紅色（不

太靈敏）；然后再點上試劑②吹干，如溶液中含有羥脯氨酸即轉變為玫瑰紅色，而其他氨基

酸與吲哚醌所生成的顏色則褪去。

7．色氨酸的顯色

(1)第一種方法

試劑：1g 對二甲氨基苯甲醛加90mL 丙酮，10mL 濃鹽酸。新鮮配制。

顯色步驟：點有樣品的濾紙干燥后，噴上以上試劑，在室溫下放置幾分鐘后，色氨酸

顯藍色或紫紅色。茚三酮顯色后，仍可使用本法。

(2)第二種方法：

試劑：10mL 35%甲醛加10mL25%鹽酸，20mL 無水乙醇。

顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上以上試劑后，100℃烘5min，色氨酸在長波長紫外光下

呈現熒光（黃-橙-帶綠色）。

8．酪氨酸的顯色

試劑：①0.1%α-亞硝基β-萘酚的95%乙醇溶液。②10%硝酸水溶液。

顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上試劑①后，吹干，再噴試劑②，然后在100℃烘3min，

酪氨酸或含酪氨酸的多肽在淺灰綠色的背景上顯紅色，0.5h 后轉變為桔紅色，其后漸退去。

靈敏度1～2μg 酪氨酸。茚三酮顯色后，再用此試劑處理，仍能顯色，茚三酮所顯出的紫紅

色斑點變成紅色。

9．酪氨酸和組氨酸的顯色——pauly 反應

試劑：①4.5g 對氨基苯磺酸與45mL 12mol/L 鹽酸共熱溶解，以蒸餾水稀釋至500mL。

用時取出30mL，在0℃與等體積的5%亞硝酸鈉水溶液相混合。（室溫放置太長會失效）

②10%碳酸鈉水溶液。

顯色步驟：點有樣品的濾紙上噴試劑①，片刻后再噴試劑②。組氨酸及含組氨酸的多

肽顯桔紅色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽顯淺紅色。

第六節 氨基酸定量測定

一、氨基酸的一般定量測定

（一）甲醛滴定法

1．原理

氨基酸具有酸性的-COOH 基和堿性的-NH2 基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內

鹽。當加入甲醛溶液時，-NH2 基與甲醛結合，從而使其堿性消失。這樣就可以用標準強堿

溶液來滴定-COOH 基，并用間接的方法測定氨基酸總量。反應式（有三種不同的推論）如

下：

2．方法特點及應用

此法簡單易行、快速方便，與亞硝酸氮氣容量法分析結果相近。在發酵工業中常用此

法測定發酵液中氨基氮含量的變化，來了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以此

作為控制發酵生產的指標之一。脯氨酸與甲醛作用時產生不穩定的化合物，使結果偏低；酪

氨酸含有酚羧基，滴定時也會消耗一些堿而致使結果偏高；溶液中若有銨存在也可與甲醛反

應，往往使結果偏高。

3．操作方法

吸取含氨基酸約 20mg 的樣品溶液于100mL 容量瓶中，加水至標線，混勻后吸取20.0mL

置于200mL 燒杯中，加水60mL，開動磁力攪拌器，用0.05mol/L 氫氧化鈉標準溶液滴定至

酸度計指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液mL 數，供計算總酸含量。

加入10.0mL 甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標準溶液繼續滴定至pH9.2，記錄消

耗氫氧化鈉標準溶液毫升數。

同時取 80mL 蒸餾水置于另一200mL 潔凈燒瓶中，先用氫氧化鈉標準溶液調至pH8．2，

（此時不計堿消耗量），再加入10.0mL 中性甲醛溶液，用0.05mol/L 氫氧化鈉標準溶液滴定

至pH9.2，作為試劑空白試驗。

4．結果計算

氨基酸態氮質量分數（%）=

式中：V1——樣品稀釋液在加入甲醛后滴定至終點（pH9.2）所消耗氫氧化鈉標準溶液

的體積，mL；

V2——空白試驗加入甲醛后滴定至終點所消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；

c——氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/L；

m——測定用樣品溶液相當于樣品的質量，g；

0.014——氮的毫摩爾質量，g/mmoL。

5．說明

①本法準確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測定。②渾濁和色深樣液可不經處

理而直接測定。

(二)茚三酮比色法

1．原理

氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍紫色化合物（除脯氨酸外均有此反應），

可用吸光光度法測定。

該藍紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長為 570nm，故據此

可以測定樣品中氨基酸含量。

2．操作方法

(1)標準曲線繪制

準確吸取 200μg /mL 的氨基酸標準溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相當于

0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分別置于25mL 容量瓶或比色管中，各加

水補充至容積為4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸鹽緩沖溶液（pH 為8.04）各

1mL，混合均勻，于水浴上加熱15min，取出迅速冷至室溫，加水至標線，搖勻。靜置15min

后，在570nm 波長下，以試劑空白為參比液測定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克

數為橫坐標，吸光度A 為縱坐標，繪制標準曲線。

(2)樣品測定

吸取澄清的樣品溶液 1～4mL，按標準曲線制作步驟，在相同條件下測定吸光度A 值，

用測得的A 值在標準曲線上可查得對應的氨基酸微克數。

3．結果計算

氨基酸含量（mg/100g）=

式中：c——從標準曲線上查得的氨基酸的質量數，μg；

m——測定的樣品溶液相當于樣品的質量，g。

4．說明及注意事項

①通常采用的樣品處理方法為：準確稱取粉碎樣品 5～10g 或吸取樣液樣品5～10mL，

置于燒杯中，加入50mL 蒸餾水和5g 左右活性炭，加熱煮沸，過濾，用30～40mL 熱水洗

滌活性炭，收集濾液于100mL 容量瓶中，加水至標線，搖勻備測。

②茚三酮受陽光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化呈淡紅色或深紅色，使用前須進行

純化，具體操作可參閱黃偉坤等編著《食品檢驗與分析》。

(三)非水溶液滴定法

1．原理

氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的標準溶液滴定其含量。根據酸

堿的質子學說：一切能給出質子的物質為酸，能接受質子的物質為堿；弱堿在酸性溶劑中堿

性顯得更強，而弱酸在堿性溶劑中酸性顯得更強，因此本來在水溶液中不能滴定的弱堿或弱

酸，如果選擇適當的溶劑使其強度增加，則可以順利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中

呈現中性，而在冰醋酸中就能接受質子顯示出堿性，因此可以用高氯酸等強酸進行滴定。

本法適合于氨基酸成品的含量測定。允許測定的范圍是幾十毫克的氨基酸

2．測定

(1)直接法（適用于能溶解于冰醋酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣品50mg 左右，溶解

于20mL 冰醋酸中，加2 滴甲基紫指示劑，用0.100mol/L 高氯酸標準液滴定（用10mL 體積

的微量滴定管），終點為紫色剛消失，呈現藍色。空白管為不含氨基酸的冰醋酸液，滴定至

同樣終點顏色。

(2)回滴法（適用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣

品30～40mg 左右，溶解于5mL0.1mol/L 高氯酸標準溶液中，加2 滴甲基紫指示劑，剩余的

酸以醋酸鈉溶液滴定，顏色變化由黃，經過綠、藍至初次出現不褪的紫色為終點。

3．說明

(1)能溶解于冰醋酸的氨基酸，可以用直接法測定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、組

氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸。不易溶解于冰

醋酸，但能溶解于高氯酸可以回滴法測定的有：賴氨酸、絲氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。

(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以將樣品溶解于2mL 甲酸中，再

加20mL 冰醋酸，直接用標準的高氯酸溶液滴定。

(四)鄰苯二甲醛法(OPT 法)

1．原理

鄰苯二甲醛在 2-巰基乙醇存在下，于堿性溶液中與氨基酸作用產生熒光化合物，最適

的激發光和發射光波長分別為340 和455nm。可能產物為：

各種氨基酸顯現的熒光強度不同，其相對熒光強度由大到小大致順序如下：天門冬氨酸，

異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨

酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸，和半胱氨酸。

本法可用于測定游離氨基酸的含量。靈敏度較茚三酮法約高 100 倍以上，可測到0.1～

1×10－4mol 氨基酸。如用于血清中α-氨基氮的測定，每次血清用量只需5～10μL。與另一

種熒光試劑（螢光胺）一樣，空白無熒光，只有與氨基酸結合才產生熒光。缺點是與脯氨酸

不產生熒光，鄰苯二甲醛與半胱氨酸熒光值太低。熒光胺已有用于氨基酸自動分析定量分析，

但由于試劑昂貴及個別氨基酸反應不滿意，目前還未普遍應用。

(五)三硝基苯磺酸法

三硝基苯磺酸（TNBS）是定量測定氨基酸的重要試劑之一。TNBS 在偏堿性的條件下

與氨基酸反應，先形成中間絡合物，如下式所示：

中間絡合物在光譜上有二個吸收值相近的高峰，分別位于355nm 和420nm 附近。然

而溶液一旦酸化，中間絡合物轉化成三硝基苯-氨基酸（TNP-氨基酸），420nm 處的吸收值

顯著下降，而350nm 附近的吸收峰則移至340nm 處。

利用 TNBS 與氨基酸反應的這一特性，可在420nm 處（偏堿性溶液中）或在340nm

（偏酸性溶液中）對氨基酸進行定量測定。下表列出各種氨基酸與TNBS 反應后在不同條

件下測定的吸光度。在340nm 處，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 處的吸光度

因氨基酸種類而異；在加入適量SO3

2－時，吸收值升高。

本法允許的測定范圍是 0.05～0.4μmol 氨基酸。

表 10-3 各種氨基酸與TNBS 反應后在不同條件下測定的吸光度

氨基酸種類 堿性溶液① 酸性溶液加 SO3

①取不同含量氨基酸液1mL，加4%NaHCO3 1mL，0.1%TNBS 1mL，于40℃反應2h，用水補充至4mL，

在420nm 處測定。制作氨基酸濃度—吸光度坐標圖，從曲線中求得各氨基酸于1μmol 時的吸光度。

②條件同上，但在與TNBS 反應時加0.01mol/L Na2SO3 1mL，最后總體積也是4mL，同樣在420nm 處

測定。

③條件同①，但與 TNBS 反應后加1mol/L HCl 1mL 酸化，在340nm 處測定。

(六)乙酰丙酮和甲醛熒光法

1．原理

氨基酸與乙酰丙酮和甲醛反應，生成 N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙酰基1,4-二氫吡啶，

產生黃-綠色熒光，可用熒光分析法檢測。主要反應如下：

乙酰丙酮 甲醛 氨基酸 熒光物質

2．試劑

混合試劑：取1mol/L 乙酸鈉溶液10mL，加入乙酰丙酮溶液0.4mL 和30%甲醛溶液1mL，

用水稀釋至30mL。

3．測定

取氨基酸液 1mL，加入混合試劑1mL，用棉花塞滿試管口，避光于100℃下加熱10min，

冷卻，加水2mL，然后測定熒光值。

表 10-4 各種氨基酸的發射波長和檢測范圍

化合物（激發波長405nm） 發射波長（nm） 檢測范圍（mg/L）

甘氨酸 485 2～10

苯丙氨酸 490 8～40

絲氨酸 485 5～25

半胱氨酸（鹽酸鹽） 500 20～100

谷氨酸 485 20～100

與標準相比較求出樣品中的氨基酸含量。

二、個別氨基酸的定量測定

（一）賴氨酸的測定

1．原理

用銅離子阻礙游離氨基酸的α-氨基,使賴氨酸的ε-氨基可以自由地與1-氟-2,4 二硝基

苯(FDNB)反應,生成ε-DNP-賴氨酸。經酸化和用二乙基醚提取,在波長390nm 處有吸收峰,

從而求出樣品中游離賴氨酸的含量.

2．試劑

(1)氯化銅液：稱28.0g 無水氯化銅，用水稀釋至1000mL。

(2)磷酸三鈉溶液：稱68.5g 無水磷酸鈉,用水稀釋至1000mL。

(3)硼酸鹽緩沖液（pH9.1～9.2）：稱54.64g 帶有10 結晶水的四硼酸鈉，用水稀釋至

1000mL 。

(4)磷酸銅懸浮液：攪拌情況下，把氯化銅液200mL，緩慢倒入400 mL 的磷酸三鈉溶液

中，把懸浮液以2000r/min 速度離心5min ，用硼酸鹽緩沖液再懸浮沉淀物，洗滌離心3 次，

把最后的沉淀物懸浮在硼酸鹽緩沖液中，并用緩沖液稀釋至1L。

(5)1-氟-2，4 二硝基苯(FDNB)溶液：吸取FDNB10mL 用甲醇稀釋至100mL。

(6)賴氨酸-HCl 標準溶液：稱取一定量賴氨酸-HCl，用水配成200mg/L 的工作標準液。

(7)100g/L 丙氨酸溶液。

3．測定

(1)稱取通過40 目篩的均勻試樣1.00g，置于100mL 燒瓶中。另吸取賴氨酸-HCl 標準工

作液5mL（相當1mg 賴氨酸-HCl），連同試劑空白同時進行試驗。

(2)向各燒瓶中加入25mL 磷酸銅懸浮液，然后再加10%丙氨酸1.0mL,振搖15min。吸

取10%FDNB 溶液0.5mL.置于各處理燒瓶中,將燒瓶置沸水中加熱15min。

(3)取出燒瓶,立即加入1mol/LHCl 溶液25mL,并不斷搖動使之酸化和分散均勻。

(4)燒瓶中的溶液冷卻至室溫,用水稀釋至100mL.取約40mL 懸浮液進行離心。

(5)用25mL 二乙基醚提取上清液3 次，除去醚。并將溶液收集于有刻度試管中,于65℃

水浴中加熱15min，以除去殘留的醚。并記錄溶液的毫升數。

(6)吸取上述各處理液10mL，分別與95%乙醇溶液10mL 混合，用濾紙過濾。

(7)用試劑空白液凋零，測定樣液A390nm，與賴氨酸-HCl 標準液對照，求出樣品中賴氨

酸-HCl 的含量。

本法在 0～40mg/L 賴氨酸溶液范圍內呈良好線性關系。

4．說明

(1)添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加總氨基酸的濃度，有助于賴氨酸-HCl 濃度

具有良好的線性關系。

(2)用醚提取酸性溶液，可將所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，并把FDWB

的產物破壞，否則這些產物在390nm 處存在干擾。

（二）色氨酸的測定

1.原理

樣品中的蛋白質經堿水解后，游離的色氨酸與甲醛和含鐵離子的三氯乙酸溶液作用，生

成哈爾滿化合物（norharman），具有特征熒光值，可以進行定量測定。

2．試劑

(1)0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸溶液：稱取三氯化鐵(FeCl3?6H2O)41mg，加入10%三

氯乙酸溶液溶解并定溶至500mL。

(2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%～38%)5.5mL，加水至100mL。

(3)色氨酸標準溶液：稱取10mg 色氨酸，用0.1mol/LNaOH 溶液溶解并定容至100mL,

置棕色瓶中備用,使用時用水稀釋成1mg/L 的標準溶液.

3．測定

稱取樣品粉末 100～200mg 于離心管中，加入4mL 乙醚,搖勻后過夜，以3000r/min 速

度離心。將乙醚提取液移入試管內,并用乙醚洗滌殘渣3 次，收集乙醚液于試管中，于40℃

水浴除去醚。殘留物中加入6.25mol/L N aOH 4mL，火焰封口，于110℃水解16～24h。水

解液用4mol/L HCl 溶液調節至pH6～8 后,用水定容至50mL,過濾備用。

吸取濾液 0.2mL，加入2%甲醛0.2mL 和0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸混合液2mL，

搖勻后于100℃水浴中加熱1h，取出，冷卻后用水定容至10mL。在激發波長為365nm，發

射波長449nm 條件下，測定樣品的熒光強度，與色氨酸標樣作對照，求出樣品中色氨酸含

量。

本法在 0～10mg/L 色氨酸溶液范圍內呈良好線性關系。

為什么氨基酸標準液中只有17種氨基酸？

氨基酸，是羧酸碳原子上的氫原子被氨基取代后的化合物，氨基酸分子中含有氨基和羧基兩種官能團。與羥基酸類似，氨基酸可按照氨基連在碳鏈上的不同位置而分為α-，β-，γ-…w-氨基酸，但經蛋白質水解后得到的氨基酸都是α-氨基酸，而且僅有二十幾種，他們是構成蛋白質的基本單位。

氨基酸溶液如何配制？

去離子水+濃度

4攝氏度下保存可以一周左右

-70℃可以保存1年以上

配制氨基酸態氮的標準溶液0.05mol

1、要給出具體的氨基酸，即可得到其摩爾質量M；

2、配制標準溶液要給出配制的濃度（例如：c=0.05mol/L）和體積(例如：v=1000ml)；

3、計算稱量氨基酸的質量 m = cvM ;

4、 在小燒杯里同分析天平稱量氨基酸的質量數，溶樣后定量轉移至1000ml容量瓶中，定容。

5、轉移到試劑瓶中，貼標簽。

求助 在用茚三酮法做氨基酸標準曲線時 為什么沒有顏色呢？或者顏色非常淺。。。

可能原因：

1、標準氨基酸含量太低

2、反應溫度未達到

3、反應后未及時測量，擱置太久

1 茚三酮配制：稱0.6g茚三酮，加入15毫升正丙醇，溶解。再加入30毫升正丁醇，60毫升乙二醇，最后加入PH5。4的乙醇-乙酸鈉緩沖液9毫升，混勻，4攝氏度棕色試劑瓶保存，可保存十天。

2 PH5。4的乙醇-乙酸鈉緩沖液：54。4克乙酸鈉加入100毫升無氨蒸餾水，加熱至沸騰，使體積蒸發至60毫升左右。冷卻，加入30毫升冰醋酸，用無氨蒸餾水定容至100毫升。

3 氨基酸標液：稱80攝氏度烘干的亮氨酸46。8毫克，用10%異丙醇定容至100毫升，為1毫摩爾/升的標準氨基酸儲備液，冰箱保存。從中取5毫升，蒸餾水定容至50毫升，為5微克/毫升氨基酸標準液。

4 氰化鈉儲備液：稱取490毫克，溶于一升無氨蒸餾水，為0。01摩爾/升。

5 10%乙酸

6乙酸-氰酸鹽緩沖液：0。01摩爾/升氰化鈉20毫升，用乙醇-乙酸鈉緩沖液定容至一升。

7標線

管號 1 2 3 4 5 6

氨基液標液（毫升）0 0。2 0。4 0。6 0。8 1

無氨蒸餾水（毫升）2 1。8 1。6 1。4 1。2 1

茚三酮（毫升） 3 3 3 3 3 3

乙酸-氰酸鹽緩沖液 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5

每管游離氨基酸含量（微克）

0 1 2 3 4 5

加完試劑后，沸水中加熱15分鐘，取后后迅速冷卻，并不時搖動，呈現藍紫色時，用60%乙醇定容至20毫升。搖勻，570納米測定吸光度。

計算：

含量（微克/100克）=C*VT*100/（VS*W）

C：從標線上查得的含量 微克

VT：樣品總體積 毫升

VS：測定時取用的樣品體積 毫升

W：樣品鮮重 克