掌握這些技術，基因克隆不是夢

在過去的幾十年里,分子生物學家已經開發許多可以用來更快地構建目的DNA序列結構的技術來簡化和規范克隆過程。

你熟悉這些克隆技術嗎?下面我們來看看這些技術的特點。

1, 限制性酶切與連接法

長期以來，限制酶切與連接法被認為是一種傳統的克隆方法。這個方法便宜靈活，可以分為兩步過程：酶切和連接。限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA片段上并切割雙鏈DNA。DNA連接酶催化兩雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中，最有用的DNA連接酶是來自T4噬菌體的DNA 連接酶：T4 DNA連接酶。這個方法原理較簡單，我不做過多介紹。

2, Gateway 克隆技術

Gateway克隆發明于九十年代末，由walhout[2]等提出，一種通用性的克隆方法，與傳統克隆方法相比，Gateway技術的優點是可以不必考慮目的DNA 是否有合適的酶切位點，也不必進行繁瑣而費時費力的酶切和連接反應，就可以按確定的方向和讀碼框快速而準確地將目的基因克隆到各種與Gateway技術兼容的目的載體上。

它利用λ噬菌體與大腸桿菌染色體之間發生的位點特異性的重組整合與切除反應，即LR和BP。BP反應是利用一個attB DNA片段或表達克隆和一個attP供體載體之間的重組反應，創建一個入門克隆。LR 反應是一個attR入門克隆和一個attR目的載體之間的重組反應。LR反應用來在平行的反應中轉移目的序列到一個或多個目的載體。重組位點attB、attP、attL和attR 由噬菌體λ和大腸桿菌編碼的酶合劑特異識別。

Invitrogen公司開發了包括運用于原核、酵母、昆蟲和哺乳動物等不同宿主的表達載體，大大提高了Gateway技術的適用性。Gateway技術已被廣泛用于高通量載體的構建

3, Gibson Assembly

傳統的限制性內切酶克隆技術，會在兩個片段的結合位置上形成一道“疤”或“縫”，這種瑕疵可能會對DNA片段的行為產生微妙的影響。這一點特別令合成生物學家頭疼，因為他們常常要將啟動子和終止子這樣的DNA片段轉變為可預測的獨立元件。Now我給大家介紹一下Gibson Assembly，一種無縫克隆方法。

Gibson組裝最早由Daniel Gibson博士和他的同事J. Craig Venter在2009年提出[3]。Gibson組裝非常適合用于拼接多個線性DNA片段，當然也適合將目的DNA插入載體中。如下圖所示，首先，需要在DNA片段的末端加上同源片段（通過PCR法加上）；然后，將這些DNA片段和一種master mix（含有三種酶）混合孵育一個小時就可以了。這種master mix含有三種不同類型的酶：1）一種外切酶，從5’端開始對DNA進行消化，產生長的黏性末端，這樣便于與另外的同源末端進行配對結合。2）一種聚合酶，用于修補gap。3）一種DNA連接酶，實現無痕拼接，形成完整的DNA分子。

這個系統最厲害的是，這三種酶都可以在同一個溫度下很好的發揮功能，所以整個反應在50攝氏度條件下一個小時就可以完成。一小時后，樣品可以直接用于轉化。當然Gibson Assembly也有缺陷，這一過程并沒有生成限制性酶切位點，因而不方便將拼接片段轉移到另一個載體上。建議最好是事先設計好限制性位點。需要注意的是，如果一次性組裝超過5個片段，成功率會大大降低。

4, Golden Gate 拼裝法

Golden Gate 拼裝法主要是依賴于一種II型限制性內切酶(ⅡS 型酶，如 BsaⅠ和 AarⅠ)，這種酶能夠在其DNA 識別處的相鄰位置進行剪切[4]。如果人為設計識別位點不同的相鄰序列，就可利用同種限制酶產生不同的粘性末端，從而一次組裝多個片段，這克服了傳統多片段組裝時限制酶種類的限制。

具體到原理：一般的內切酶分為三種，通常用的是2類的酶，識別特定的回文序列，并從中切開。而golden gate一般用的是3類酶，一般以bsmb 1，Bsa1, Bbs1這三種酶，識別特定的序列，并在特定序列以后隔幾個任意的堿基切開，這樣子就可以克服2類酶必須要回文序列才能用的缺點，實現片段的連接。

另外，要說的是連接部分，傳統的連接酶是T4用的比較多，T4可以連接黏性末端跟平末端，而golden gate里用的是T7，它的特點是只能實現連接黏性末端。因為T7的這一特性，所以在連接的時候可以把片段跟切好的載體混到一種特殊的buffer里，在這里內切酶跟T7都可以保持比較高的活性，通過溫度的調節，實現克隆的構建。因為用的是T7，所以不用擔心PCR片段自連降低克隆效率，又因為是用的三類酶，可以通過黏性末端的設計，可以一種酶切多個片段，又不用擔心這幾個片段之間的亂連，來達到分子克隆的目的[5]。

5, TOPO克隆(TA克隆)

TOPO克隆使用DNA拓撲異構酶I，該酶同時具有限制酶和連接酶的特性。這種酶在復制期間切割并重新連接DNA，整個克隆過程可以在室溫下完成，且僅需5分鐘。TOPO克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需在PCR擴增產物上加接頭，即可直接進行克隆。

Topo TA克隆原理與TA克隆一樣，唯一不同的是TA克隆用的是T4連接酶把PCR片斷連接到T載體上，而Topo TA Cloning用的是DNA 拓撲異構酶I。

pCR-TOPO 載體也是一種 T 載體，只是在其 3’末端的突出 T 上共價結合了一個拓撲異構酶 Ⅰ ，當帶 3′ 末端的突出 A 的 PCR 產物與該 T 載體互補配對時，拓撲異構酶 Ⅰ 就將該缺口連接起來。

自沃森，克里克在1953年發現DNA雙螺旋結構不過60余年，如今的DNA克隆技術卻已發展到如此的程度。合成生物學正處在高速發展時期，這些進步技術的進步必將推動生物革命浪潮的到來。你都掌握了嗎？

Reference

[1] 李華琴,林陳水,張文倩. 不依賴連接反應的高通量克隆方法. 氨基酸和生物資源.2013,35(4):43-46

[2] Walhout A J M, Temple G F, Brasch M A, et al. GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes[J]. Methods in enzymology, 2000, 328: 575-IN7.

[3] Gibson, D.G., et al. (2009) Nat. Methods 6, 343-345.

[4] Morbitzer R, Elsaesser J, Hausner J, et al. Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning[J]. Nucleic acids research, 2011, 39(13): 5790-5799.

[5]

Amino Acids & Biotic Resources影響因子？

一、氨基酸和生物資源 Amino Acids and Biotic Resources 本刊是我國唯一一種以生物資源為主題，氨基酸為特色的科技期刊。分為生物資源研究、保護與利用；農副資源研究與利用；生物技術及制品；氨基酸生產技術；氨基酸和生物資源與人類健康；分析檢測技術；氨基酸應用；生物產業和生命科學工作者等8個欄目。在生命科學、資源科學、生物工程、飼料科學、食品科學、醫藥學、營養學等領域深受歡迎。本刊被國內許多文摘和數據庫所收錄。讀者主要為科技工作者、大中專院校師生、技術人員和工人等。 二、基因組蛋白質組與生物信息學報（英文版）Genomics、Proteomics Bio.rmatics Genomics, Proteomics Bio.rmatics (《基因組蛋白質組與生物信息學報》，簡稱GPB)創刊于2003年，是由中國科學院北京基因組研究所主辦、科學出版社出版的國家級英文學術期刊，由楊煥明教授、于軍教授擔任主編，汪建教授、賀福初院士擔任副主編。本刊主要刊載基因組學、蛋白質組學、生物信息學及其相關領域的研究進展、綜述、研究論文、實驗技術與方法、研究快訊等高質量的稿件，突出刊物的學術性、前沿性、指導性和實用性。本刊讀者對象為基礎醫學、生命科學、農學、計算機科學領域的科研與教學人員、研究生等，以及數學、物理學領域對生物科學有興趣的研究者。 三、生命科學 Chinese Bulletin of Life Sciences 本刊以評述、綜述、研究簡訊（動態）等形式報道國內外生命科學研究的發展趨勢、學術動態和研究成果，重點報道生命科學領域的評述性或綜述性文章和國家自然科學基金資助的生命科學有關的項目介紹、研究進展、管理經驗和問題咨詢，同時也報道該領域的研究動態、研究成果、科學家介紹、研究機構介紹和書評等內容。 四、生命科學研究 Life Science Research 本刊是中國以生命科學命名的唯一的全國綜合性學術期刊。主要反映世界各國生命科學領域中的最新研究成果，所刊登的論文90%來源于中國國家自然科學基金、國家科技部重大項目基金以及省級科學基金。經過專家評審，論文達到國家先進水平及國內外先進水平的共占85%以上。《生命科學研究》嚴格執行 ISO8，ISO31，ISO1000，ISO5966等國際標準，遵守國際慣例，逐步實現編排格式國際標準化，1999年被湖南省評定為科技學術類一級期刊，2000年被評為全國CAJ-CD規范執行優秀獎。 五、中國生物工程雜志 China Biotechnology 本刊由中科院文獻情報中心和國家科技部中國生物工程開發中心共同主辦，是我國生物工程領域全國性學術團體、國家一級學會——中國生物工程學會會刊。《中國生物工程雜志》(月刊)內容涉及醫藥生物技術、農業生物技術、輕化工生物技術、環境生物技術、海洋生物技術等專業領域。設有學術論文、研究進展、研究報告、專題論述、技術與方法、評論、新聞報道、生物工程領域知識產權研究、市場與商情、會議消息、動態等欄目，還以雜志專集、增刊等的形式出版生物工程專題著述。本刊創刊于1976年，是我國最早創刊的中央級綜合性生物工程專業刊物，編輯委員會由國內知名生物工程專家、管理部門領導組成，發行面覆蓋全國各省、自治區、直轄市、香港、臺灣及海外有關大學、研究機構、圖書館也有相當的訂戶，和海外建立有廣泛的刊物交換聯系并被國內外著名檢索系統收錄。 希望我的回答可以為你提供一些幫助O(∩_∩)O~
回答時間：2011-10-24 3:01:16

氨基酸資源和生物資源是中文核心嗎

氨基酸資源和生物資源不是中文核心

氨基酸資源和生物資源雜志創刊于1975年，不定期出版，共出版發行12期。

中文核心期刊是學術界對某類期刊的定義，一種期刊等級的劃分。它的對象是，中文學術期刊。是根據期刊影響因子等諸多因素所劃分的期刊。

而氨基酸資源和生物資源并不在中文核心期刊目錄中，所以氨基酸資源和生物資源不是中文核心

大鯢的主要價值

娃娃魚的背部色彩斑斕，前肢四指似人手，后肢五趾如人足，嘴邊特大叫聲洪亮，酷似嬰兒，故名娃娃魚，大鯢的壽命在兩棲動物中是較長的，在人工飼養的條件下，可長達50～60余年，野生狀態下可存活130余年，故也有人叫他“壽星魚”，大鯢作為觀賞動物歷來為人民所喜愛，可使公園、動物園和游覽區增加新奇的景觀。

張家界將為國內最大的娃娃魚“笨笨”申報吉尼斯世界紀錄。這條取名“笨笨”的中國大鯢，2005年曾在張家界國際森林保護節上與公眾見面，當時展出時長約180厘米，重約65公斤，娃娃魚“笨笨”已近130歲的高齡，體長近2米，是迄今為止國內發現的最大娃娃魚。

據介紹，“笨笨”是張家界白族農民王國興1982年從鄰鄉群眾手中收購而來，當時重約45公斤，體長約150公分。隨著大鯢“笨笨”年老體弱，怕光怕人，“笨笨”被放回張家界國家大鯢自然保護區內的純天然溶洞里生活。“笨笨”擁有方（張家界金鯢生物公司）負責人王建文說：“為喚醒國內對大鯢這種珍稀動物的保護意識，該公司決定為笨笨申報世界紀錄”。王建文表示，他們將為“笨笨”申報吉尼斯動物類世界之最，相關申報材料將于2013年1月正式遞交英國吉尼斯總部。 警告：國家規定大鯢（娃娃魚）只有子二代可以進行食用和買賣，違法捕獲、獵殺、販賣、食用野生大鯢將受到法律制裁。

大鯢是一種食用價值極高的動物，其肉質細嫩、味道鮮美，含有優質蛋白質、豐富的氨基酸和微量元素，營養價值極高，被譽為“水中人參”，在中國香港、臺灣及東南亞市場上被視為珍稀補品。大鯢肌肉蛋白是一種優質蛋白，必需氨基酸含量高，組成比例好，完全符合人體需要量模式。大鯢肌肉蛋白富含18種氨基酸，其中6種呈味氨基酸占氨基酸總量的42.77 %，8種人體必需氨基酸占氨基酸總量的40.72 %，必需氨基酸與非必需氨基酸比值為68.68 %，均符合FAO/WHO的理想模式；大鯢必需氨基酸評分高，符合人體需要量模式程度相當高, 其中含有豐富的我國主食中容易缺乏的賴氨酸, 可以與主食合理搭配食用, 以起到蛋白質互補作用。

大鯢蛋白與幾種珍貴食物蛋白必需氨基酸質量分數的比較/mg.g?1 必需氨基酸名稱大鯢蛋白質甲魚蛋白質鮑魚蛋白質燕窩蛋白質魚翅蛋白質蘇氨酸 45.04 43.56 11.90 76.81 41.20 纈氨酸 49.91 49.16 16.50 50.86 46.50 胱氨酸+蛋氨酸 42.00 41.70 31.98 5.86 30.30 異亮氨酸 51.12 34.85 9.45 25.95 43.90 亮氨酸 83.38 72.18 15.77 57.14 69.80 苯丙氨酸+酪氨酸 80.34 73.43 34.83 86.23 68.00 賴氨酸 89.47 79.65 10.41 43.95 68.90 色氨酸 16.43 — 10.97 0.42 9.00 此表摘自：劉紹, 孫麟, 陽愛生, 倉道平, 賈濤, 趙厚民, 廖興華, 陳冬純. 飼養中國大鯢氨基酸組成分析[J]. 氨基酸和生物資源, 2007, 29(4): 53-55.

大鯢肌肉中脂肪含量雖然不高，但必需脂肪酸含量高，特別是二十二碳六烯酸（DHA）含量豐富，具有與深海魚類相似的必需脂肪酸組成和較高DHA含量的特點。大鯢脂肪中不飽和脂肪酸（UFA）高達71.13 %，其中單不飽和脂肪酸（MUFA）為42.18 %，多不飽和脂肪酸（PUFA）為28.15 %，具有保健作用的ω-6型PUFA為13.10 %，ω-3型PUFA為15.15 %，對預防心腦血管疾病具有良好的作用，是治療燙傷、燒傷的特效藥。

多不飽和脂肪酸（PUFA）是研究和開發功能性脂肪酸的主體和核心，其主要包括亞油酸（LA）、γ- 亞麻酸（GLA）、α- 亞麻酸（GLA）、花生四烯酸（AA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等，其中，亞油酸及α-亞麻酸被公認為人體必需的脂肪酸（EA），在人體內可進一步衍化成具有不同功能作用的高度不飽和脂肪酸，如AA、EPA、DHA等。花生四烯酸既是人體大腦和視神經發育的重要物質, 也是前列腺素合成的前體物質。二十二碳六烯酸（DHA），俗稱“腦黃金”，是一種對人體非常重要的多不飽和脂肪酸，對嬰兒智力和視力發育至關重要。食用富含PUFA的魚油具有預防心肌梗塞、心律不齊、降低血脂、動脈粥樣硬化、冠狀動脈硬化、抗氧化清除自由基、抗衰老等功能。

大鯢與甲魚的重要脂肪酸含量比較/ mg.100g?1 脂肪酸名稱亞油酸亞麻酸花生四稀酸二十二碳六烯酸大鯢肌肉 79.9 28.6 44.6 146.3 甲魚肌肉 7.5 — 3.4 4.6 此表摘自：劉紹, 劉卉琳, 周治德, 彭國平, 陳冬純, 廖興華, 陽愛生, 倉道平. 飼養中國大鯢肝臟與肌肉中幾種重要脂肪酸的測定與分析[J]. 食品與機械, 2009, 25(3): 21-26.

大鯢肌肉中富含微量元素鋅, 含有一定量的硒, 大鯢軟骨中含有大量鈣，肝臟中含有豐富維生素，如VB1、VB2、VA、VD與尼克酸等。大鯢肌肉中鋅含量相當高，是常見淡水魚和海水魚類的數倍。微量元素鋅能夠誘導金屬硫蛋白（MT）的合成, 而MT能夠與進入機體的有毒的重金屬鎘、汞、鉛等結合, 從而使之失去毒性，這對處于鎘、汞、鉛污染地區的人們體內排鉛排鎘排汞具有相當積極的意義。經常食用大鯢肉能夠延緩衰老，提高機體免疫力。 警告：國家規定大鯢（娃娃魚）只有子二代可以進行食用和買賣，違法捕獲、獵殺、販賣、食用野生大鯢將受到法律制裁。

大鯢是一種傳統名貴藥用動物，其肌肉、內臟、骨骼、表皮及其分泌物均可入藥，在歷代方石中多有記載。如《本草綱目》中有“鱗目、四部、大鯢……以癡疾”。《本草經集注》、《本草拾遺》等藥典中也有“治癡疾、治牛、治斑疾”的描述，表明了大鯢入藥在提高智力、美容、益膚方面有顯著功能。中醫認為，大鯢性甘平味淡，有補氣、養血、益智、滋補、強壯之功效，主治神經衰弱、貧血、痢疾、瘧疾等，用于病后、產后身體虛弱，腎虛陰虧，肺癆咯血，久痢脫肛等。現代醫學認為，經常食用大鯢可聰明益智延緩衰老提高造血和免疫功能，對防止心腦血管系統疾病，惡性貧血和惡性腫瘤有很好的效果。鯢皮粉拌桐油可以治療燒傷、燙傷，尤其是對面部的燒燙傷的治療不留疤痕。大鯢皮膚黏液細胞中釋放黏糖蛋白后，與水結合即成黏液，覆蓋在上皮游離面，形成了一道天然的防護屏障。黏液主要成分為黏多糖蛋白和纖維物質，還有多種激素，及“蛙皮素”，具有較強的抗菌作用，可預防麻風病、老年癡呆和防治癌癥。大鯢肝臟中含有豐富的金屬硫蛋白，能有效消除人體內有害的“自由基”，并可吸收外資結合有害金屬離子將其排出體外，起到有效的“排毒”作用。

大鯢皮膚中含有大量活性膠原蛋白（COLLAGEN）及表皮活性變白因子（CHF），能夠使人體皮膚保持彈性、潤滑細膩、健康白嫩，被稱為養顏美白圣品，具有極強的美容功效。

大鯢全身都是寶，是一種集保健、藥用、美容為一體的珍貴物種，被專家譽為“水中人參”、“軟黃金”。 體內含有50多種天然活性物，能夠促進人體生理活性，改善人體生理代謝水平，促進人體蛋白質合成，提高人體免疫功能，增強抗病能力。